嘌呤霉素是一種蛋白質(zhì)合成抑制劑,它具有與tRNA分子末端類似的結(jié)構(gòu)，能夠同氨基酸結(jié)合，代替氨酰化的tRNA同核糖體的A位點(diǎn)結(jié)合，并摻入到生長的肽鏈中。用嘌呤霉素篩選細(xì)胞方法如下：
嘌呤霉素篩選細(xì)胞
轉(zhuǎn)染(24孔板進(jìn)行)或電轉(zhuǎn)后培養(yǎng)24小時(shí)，按10%密度傳代(傳至36mm平皿)，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞密度增至20%-25%回合時(shí);
去掉培養(yǎng)液，PBS洗一次，加入按照最佳嘌呤霉素篩選細(xì)胞的濃度(殺傷曲線試驗(yàn)確定)配制好的嘌呤霉素篩選細(xì)胞培養(yǎng)基2-3ml。
根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞的存活情況，每隔2天更換一次嘌呤霉素篩選細(xì)胞用培養(yǎng)基(培養(yǎng)基用量為2-4ml，細(xì)胞多，多家培養(yǎng)基，細(xì)胞少，少加培養(yǎng)基)，一般在3-1天內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞大量或少量死亡情況(如果轉(zhuǎn)染效率或電轉(zhuǎn)效率高，則死亡少;
如果轉(zhuǎn)染率或電轉(zhuǎn)率低，則死亡多;如果篩選濃度偏低，嘌呤霉素篩選細(xì)胞培養(yǎng)基用量少，細(xì)胞密度大于80%，會(huì)導(dǎo)致大量假陽性克隆)。
如果少選第一周，出現(xiàn)細(xì)胞大量死亡，則在原培養(yǎng)皿中繼續(xù)加入嘌呤霉素篩選細(xì)胞培養(yǎng)基篩選一周;如果刪選第一周，出現(xiàn)細(xì)胞少量死亡，則把細(xì)胞按照10%密度傳代(傳至35mm平皿，傳一個(gè)皿即可，多余細(xì)胞丟棄)，利用少選培養(yǎng)基進(jìn)行篩選一周;
篩選第二周結(jié)束后，則把細(xì)胞消化下來。進(jìn)行重點(diǎn)稀釋(10ul培養(yǎng)基中含1個(gè)細(xì)胞，用篩選培養(yǎng)基)，把上述10ul細(xì)胞懸液假日96孔板中(提前加入40ul篩選培養(yǎng)基)，伊紅加入24孔，4小時(shí)候觀察每個(gè)孔的情況。記錄只含一個(gè)細(xì)胞的孔，含有一個(gè)細(xì)胞的孔用于繼續(xù)篩選，其余孔舍棄;
根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長情況換入新的嘌呤霉素篩選細(xì)胞用培養(yǎng)基待細(xì)胞密度為80%時(shí)，將其傳代至24孔板中增殖，待細(xì)胞密度為80%時(shí)，將其傳代至6孔板中增殖，待細(xì)胞密度為80%時(shí)，將其傳代至T25瓶(一傳3)中增殖，每隔3天換液。
細(xì)胞大量擴(kuò)增后，一瓶用于提取中RNA進(jìn)行QPCR檢測，一瓶用于總蛋白進(jìn)行WB檢測，另一瓶用于保種，根據(jù)QPCR和WB結(jié)果取舍陽性克隆。
嘌呤霉素篩選細(xì)胞方法如上，具體的嘌呤霉素篩選細(xì)胞讓發(fā)如上，嘌呤霉素穩(wěn)定性高，可以常溫運(yùn)輸，收到產(chǎn)品后4℃存放;
嘌呤霉素在室溫條件下可存放3個(gè)月，4℃條件下保質(zhì)期一年。為了達(dá)到理想的穩(wěn)定狀態(tài)和最長的保質(zhì)期，最好存放于-20°C，保質(zhì)期為2年。