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技術(shù)文章
看完這些你就知道什么是酵母雙雜交載體了
  酵母雙雜交載體是將待研究的兩種蛋白質(zhì)分別克隆(融合)到酵母表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活因子(如GAL4等)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-BD)和轉(zhuǎn)錄激活域(AD)上,構(gòu)建成融合表達(dá)載體,從表達(dá)產(chǎn)物分析兩種蛋白質(zhì)相互作用的系統(tǒng)。
 
  酵母雙雜交載體的建立是基于對(duì)真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程的認(rèn)識(shí)。細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。
 
  反式轉(zhuǎn)錄激活因子,例如酵母轉(zhuǎn)錄因子 GAL4在結(jié)構(gòu)上是組件式的(modular),往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上結(jié)構(gòu)上可以分開(kāi),功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域(domain)構(gòu)成,其中有DNA結(jié)合功能域(DNA binding domain,DNA-BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain,DNA-AD)。
 
  這兩個(gè)結(jié)合域?qū)⑺鼈兎珠_(kāi)時(shí)仍分別具有功能,但不能激活轉(zhuǎn)錄,只有當(dāng)被分開(kāi)的兩者通過(guò)適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時(shí),才能重新呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性,并可激活上游激活序列(upstream activating sequence,UAS)的下游啟動(dòng)子,使啟動(dòng)子下游基因得到轉(zhuǎn)錄。
 
  雙雜交系統(tǒng)的建立得力于對(duì)真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程的認(rèn)識(shí)。細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。
 
  80年代的工作表明, 轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式的(modular), 即這些因子往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,其中有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain,簡(jiǎn)稱為BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain,簡(jiǎn)稱為AD),它們是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。
 
  單獨(dú)的BD雖然能和啟動(dòng)子結(jié)合,但是不能激活轉(zhuǎn)錄。而不同轉(zhuǎn)錄激活因子的BD和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄的功能。
 
  如酵母細(xì)胞的Gal4蛋白的BD與大腸桿菌的一個(gè)酸性激活結(jié)構(gòu)域B42融合得到的雜合蛋白仍然可結(jié)合到Gal4結(jié)合位點(diǎn)并激活轉(zhuǎn)錄。
 
  在酵母雙雜交系統(tǒng)中,"誘餌"蛋白X克隆至DNA-BD載體中,表達(dá)DNA-BD/X融合蛋白;待測(cè)試蛋白Y克隆至AD載體中,表達(dá)AD/Y融合蛋白。
 
  一旦X與Y蛋白間有相互作用,則DNA-BD和AD也隨之被牽拉靠近,恢復(fù)行使功能,激活報(bào)告重組體中LacZ和HIS3基因的表達(dá)。
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